口蹄疫A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒說明書

【用途】

用于檢測牛、羊和豬等偶蹄動物血清樣品中口蹄疫病毒A型抗體，適用于動物疫苗免疫抗體定量檢測。

【規格】1*96T/盒或5*96T/盒

【試劑盒組成】

注：不同批號試劑盒中各組分不得混用。

【貯藏條件及有效期】2～8℃保存，有效期為12個月。

【用法與判定】

在使用前，所有的試劑盒組份應恢復到室溫。試劑應輕輕旋轉或振蕩混勻。

1．試劑準備

洗滌液配制：將濃縮20×洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋成洗滌液(1×)，即1份濃縮20×洗滌液加入19份蒸餾水，配制的洗滌液(1×)用于洗板和血清樣品稀釋。

病毒抗原：口蹄疫A型抗原已稀釋至工作濃度，直接使用。

2．操作步驟

取出包被板，根據不同的需要，選擇圖1或圖2中的一種布局進行操作。圖1為可檢測10份樣品布局圖；圖2為可檢測20份樣品布局圖。每次試驗，每板均需設置陰陽性血清對照及4孔不加血清單病毒抗原對照。

2.1待檢樣品稀釋：

以圖1為例操作，首先，在包被板上，A1～A10每孔各加75µl的洗滌液(1×)，在第1～11列其它所有孔以及第12列的A12～B12內各加入50µl的洗滌液(1×)。

其次，再在A1～A10每孔各加25µl的待檢樣品，A11孔加50µl的陽性對照，A12孔加50µl的陰性對照，然后，以50µl/孔的量，用洗滌液(1×)連續2倍稀釋每份被檢血清，使每孔最終量都為50µl；

待檢樣品A1～A10分別以50µl/孔的量從A到H連續2倍稀釋；

陽性對照A11以50µl/孔的量從A到H連續2倍稀釋；陰性對照A12以50µl/孔的量從A到B連續2倍稀釋。E12~H12孔為病毒抗原對照孔。

待檢樣品在第1～10列從1:4稀釋至1:512；陽性對照，從1:2稀釋至1:256，由于試劑盒提供的陽性對照已1:8稀釋，則變為從1:16稀釋至1:2048；陰性對照，從1:2稀釋至1:4。

圖1  96孔包被板檢測10份樣本布局圖

以圖2為例操作，首先，在包被板上，A1～A10孔以及E1～E10孔，每孔各加87.5µl的洗滌液(1×)，在第1～11列其它所有孔以及第12列的A12～B12內各加入50µl的洗滌液(1×)。

其次，再在A1～A10孔以及E1～E10孔，每孔各加12.5µl的待檢樣品，A11孔加50µl的陽性對照，A12孔加50µl的陰性對照，然后，以50µl/孔的量，用洗滌液(1×)連續2倍稀釋每份被檢血清，使每孔最終量都為50µl；

待檢樣品A1～A10分別以50µl/孔的量從A到D連續2倍稀釋；待檢樣品E1～E10分別以50µl/孔的量從D到H連續2倍稀釋；

陽性對照A11以50µl/孔的量從A到H連續2倍稀釋；陰性對照A12以50µl/孔的量從A到B連續2倍稀釋。E12~H12孔為病毒抗原對照孔。

待檢樣品在第1～10列從1:8稀釋至1:64；陽性對照，從1:2稀釋至1:256，由于試劑盒提供的陽性對照已1:8稀釋，則變為從1:16稀釋至1:2048；陰性對照，從1:2稀釋至1:4。

圖2  96孔包被板檢測20份樣本布局圖

2.2加病毒抗原：使用已稀釋好的口蹄疫A型抗原加樣，其中預設的4孔病毒抗原對照孔按100µl/孔加入，其余待檢血清、陰陽性對照按50µl/孔加入。加樣完畢，所有樣品孔和陰陽性對照孔稀釋度翻倍，變為圖1、圖2所示。振蕩混勻，封板，37℃溫育30分鐘。

2.3洗板后加酶：棄去孔中液體，用洗滌液(1×)以300µl/孔的量連續洗滌4次，拍干孔中殘留液體。然后按100μl/孔加入酶標抗體，振蕩混勻，封板，37℃溫育30分鐘。

2.4洗板后加底物：棄去孔中液體，用洗滌液(1×)以300µl/孔的量連續洗滌4次，拍干孔中殘留液體。然后100μl/孔加入底物溶液(顯色液A和B按1:1混合均勻)，封板，37℃避光溫育15分鐘。

2.5終止后讀數：按50μl/孔加入終止液終止反應，立即在450nm波長下讀取OD值。

3．結果判定

3.1試驗成立條件

每塊板設4孔病毒抗原對照，病毒抗原對照OD_450nm值應在1.0以上。陽性對照抗體效價應在1:1024±1滴度以內，陰性對照血清抗體效價應<1:8。

3.2血清抗體效價的判定

病毒抗原對照4孔，棄去最高和最diOD_450nm值，計算剩余2孔的平均OD_450nm值，再除以2，即50%對照值，該值即為臨界值，表示阻斷50%反應的對照OD_450nm值。被檢血清OD_450nm值>臨界值的孔，判為陰性孔；被檢血清OD_450nm值≤臨界值的孔，判為陽性孔。

若臨界值與稀釋倍數最高陽性孔的OD_450nm值相同，則以被檢血清陽性孔的最高稀釋倍數作為該份血清的抗體效價；若臨界值處于2孔之間，抗體效價取相鄰陽性孔和陰性孔稀釋倍數的反對數中間值，如處于1:64(反對數值為1.8）與1:128（反對數值為2.1）之間，則判定該份血清的抗體效價為1:90（反對數值為1.95），具體判定可見抗體效價計算對照表。

抗體效價計算對照表

3.3結果判定

陽性：血清樣品抗體效價≥1:128，判為口蹄疫A型抗體陽性；

陰性：血清樣品抗體效價＜1:64，判為口蹄疫A型抗體陰性；

可疑：血清樣品抗體效價在1:64-1:128之間，判為可疑；可疑血清樣品需要復檢，復檢抗體效價≥1:128，判為陽性；抗體效價＜1:128，判為陰性。

3.4 ELISA抗體效價與免疫動物攻毒保護的關系

牛、羊：抗體效價≥1:128，99%以上保護；效價≤1:16，不保護；效價在1:22~90之間，50%保護。

豬：≥1:64，99%以上保護；效價<1:4，不保護；效價在1:4~45，50%保護。

【注意事項】

1. 實驗前請仔細閱讀本說明書。

2. 使用前需確認試劑盒有效期，應在有效期內使用。

3. 所有試劑使用前恢復至室溫(18～26℃)，以免溫度過低影響抗原抗體反應。

4. 試劑盒所有濃縮試劑在低溫放置下，可能有無機鹽結晶，如果有結晶鹽出現，可在37℃溫育至溶解后使用，不影響實驗。

5. 實驗前應用溫度計檢查溫箱溫度，溫度過高或過低影響OD值高低。

6. 待檢血清樣品數量較多時，應盡量縮短加樣時間。

7. 包被板反應時嚴禁堆疊放置，應該平鋪且板間有空隙，不要離溫箱壁太近。

8. 終止反應后應立即用酶標儀讀數，應在10分鐘內完成。

9. 實驗所用移液器及設備應定期校準。

10. 采集的樣品要新鮮，并且最好不要溶血。血清標本在2～8℃放置不要超過2天，室溫不超過8小時，如需長時間放置應儲存于-20℃。